The plasticity of transcription

Nature Genetics. 39, 730-732 (2007)
Tissue-specific transcriptional regulation has diverged significantly between human and mouse

今月のNature Geneticsに掲載された上記論文は大変面白い。
生命の進化の過程で保存された転写調節メカニズムは異種間の転写因子の標的配列の相同性に準じると多くの人は想像するかもしれません。
同じ転写因子であればマウスとヒトで結合遺伝子は同じだろうか。結合部位は同じだろうか。異種間で保存されたアライメントに準じて結合するだろうか。
答えはNoである。
それをこの論文は検証した。
進化的に保存された同じ転写因子であっても結合が異種間でかなり異なることを示したこの論文は同じほ乳類としてヒトの代用を果たしているマウスの研究結果に再考を迫るだろう。

方法はChIP-on-chipです。
まずカスタムメイドのマイクロアレイですが、彼らは4000種類以上のヒトとマウスのオーソログ(異種間相同遺伝子)に対して転写開始点前後5kbの範囲で60merのオリゴヌクレオチドをプローブとして設計した。
抗体は４つの転写因子(FOXA2,HNF1A,HNF4A,HNF6)を用い、細胞はヒトとマウスの肝臓からそれぞれ単離した初代肝細胞を用いた。

結果はこれらの転写因子が結合するオーソログの実に41-89%がヒトとマウスで異なるという驚くべき結果だった。つまり同じ転写因子であってもその結合遺伝子の41-89%は種特異的である。
またHNF6についてヒト初代肝細胞と不死化ヒト肝細胞株であるHepG2を比較したところ、結合オーソログの66%を共有したのに対して、マウス初代肝細胞とは26%しか結合オーソログを共有しなかった。つまり異種間の違いは初代培養細胞と不死化細胞株という同種間の違いよりも大きい。

異種間の結合パターンの違いは転写因子のDNA結合特異性の違いに起因するのではなく、蛋白モチーフに合致した配列の有無と強く相関することをTHEMEアルゴリズムで示した後に、結合する場合も結合部位は種間でかなり異なることを示しています。すなわち 同じ転写因子の結合部位をヒト-マウス間で比較した結果、約2/3でアライメントの一致が認められず、結合部位はヒト-マウス配列アライメントからだけでは予測できないことを示しています。
ヒトとマウスにおけるこの違いは転写因子結合部位の高い可動性を意味します。この転写因子結合の高い可塑性は異種間で保存された領域が機能的に重要だという前提の方法論であるファイロジェネティックフットプリンティングにも再考を迫る論文ではないかと思います。

Faecal occult blood test

Gut. 2007 Feb 19
Evaluation of a card collection based faecal immunochemical test in screening for colorectal cancer using a two-tier reflex approach

Lancet Oncology. 2006 Feb;7(2):127-31.
Immunochemical testing of individuals positive for guaiac faecal occult blood test in a screening programme for colorectal cancer: an observational study.

便潜血検査は大腸癌死亡率減少効果を示す十分な証拠があることから、大腸がん検診の基本的項目として確立しています。
化学法と免疫法という2種類の検査法がありますが、現在主流となっているのは免疫法です。

化学法は便中にペルオキシダーゼがある場合に過酸化水素存在下で基質であるグアヤックのフェノールが酸化されてキノンになり青い発色を呈する反応を利用しています。ヘモグロビンはペルオキシダーゼ活性を持っているので便中にヘモグロビンが存在する場合は発色するという理屈ですが、ヘモグロビン以外にもペルオキシダーゼ活性が生じる場合があるため、偽陽性を避けるために化学法では食事内容や内服薬の制限があります。
その点免疫法ではヒトヘモグロビンを抗原とした抗原抗体反応を利用しているので特異度が高く、食事内容や内服薬の制限もありません。上部消化管出血に対しては感度が低いものの大腸癌のスクリーニングとしては化学法に劣らず優れています。
これまでの疫学試験で化学法・免疫法ともに大腸癌死亡率減少効果があることが示されています。

以上は机上の学習ですが、実際の臨床現場では化学法が陽性で免疫法が陰性というケースがある。
この場合下部消化管内視鏡を行うか否かについてはおそらく医師の判断が分かれる。

今年2月のGutに発表された前者の論文では便潜血化学法陽性者に対して免疫法を追加検査する２段階スクリーニングの意義を検証しています。便潜血化学法陽性者558人を対象に免疫法を行った結果302人が陰性で256人が陽性だった。免疫法陰性者302人のうち2人(0.7%)に癌、12人(4.0%)にハイリスクポリープが確認された。一方免疫法陽性者の254人では47人(18.5%)に癌、54人(21.3%)にハイリスクポリープが確認された。また免疫法陰性者の93人(30.8%)は正常所見であったのに対して、免疫法陽性者では正常所見は34人(13.4%)だった。これらの結果から便潜血化学法陽性者に対して免疫法を追加検査する2段階スクリーニングによって大腸癌のハイリスク者を効果的に抽出できるとしています。

昨年のLancet Oncologyに掲載された後者の論文でも同様のスタディを行っていますが、こちらは便潜血化学法陽性者に対して免疫法を2回行っていて、免疫法の結果両方陽性をP/P、両方陰性をN/N、一方が陰性で他方が陽性をN/Pとして、それらと大腸内視鏡の結果を照合しています。
便潜血化学法陽性者800人のうちN/Nは173人(22%)、N/Pは129人(16%)、P/Pは498人(62%)で、大腸内視鏡を受けた795人のうち癌が見つかったのはN/Nが1/171人(1%未満）、N/Pが1/127人(1%未満）、P/Pが38/497人(8%)であった。また腺腫性ポリープが見つかったのはN/Nが28/171人(16%）、N/Pが24/127人(19%）、P/Pが193/497人(39%)で、正常所見はN/Nが67/171人(39%）、N/Pが49/127人(39%）、P/Pが24/497人(17%)であった。以上の結果から便潜血化学法陽性者に対する免疫法の追加検査は大腸癌スクリーングの偽陽性をかなり減らせるとしています。

便潜血化学法陽性者に対して免疫法が陰性であることが大腸内視鏡を行わない理由になるかどうかについてはケースバイケースだと思われます。

RAS inhibitors

American Journal of Kidney Diseases May 2004, Supplement Volume 43 Number 5
K/DOQI clinical practice guidelines on hypertension and antihypertensive agents in chronic kidney disease

Chronic kidney diseaseに対してどこまでACE阻害薬やARBといったRAS阻害薬を増量するかについては議論のあるところですが、Dose Effectが存在することについては異論がない。

実際に処方をする立場としてはこれまでに行われたトライアルで使用された処方に科学的根拠を求めることになります。RAS阻害薬の腎保護作用に関する論文は山のようにあるのでそれら全てに目を通すのは大変ですが、主要な論文については具体的な処方量を調べてみました。

上記のK/DOQI clinical practice guidelinesにはACE阻害薬とARBのDose Rangeが表として記載されているので参考になるかもしれませんが、2004年の記載でかつ根拠となるトライアルについての情報がないので、その点はUpToDateの方が参考になります。

これまでの主要なトライアルで使用された頻度が高い薬剤としてはACE阻害薬ではベナゼプリル、 ラミプリル 、エナラプリル、ARBではロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタンといったところです。
ベナゼプリルについては昨年の N Engl J Medに有効性と安全性についてのスタディが報告されていて、ここで使用されたベナゼプリルの量は20mg/日です(N Engl J Med 2006;354:131-40)。
ラミプリルは一連のREINトライアルで使用されたことで有名ですが、そこで使用された最大量は5mg/日です。エナラプリルはトライアルによって5-40mg/日と差が大きい。

ARBについてはロサルタンがCOOPERATEで使用された量が100mg/日(Lancet 2003; 361: 117-24)、 バルサルタンはHKVINで使用された量が160mg/日となっています(American Journal of Kidney Diseases Vol 47, No 5 May, 2006: pp 751-760)。カンデサルタンについては極量を超えたUltra dose effectを検証したスタディがあり、そこでは32mg/日と64mg/日を比較しています(J Am Soc Nephrol 16: 3038-3045, 2005)。

COOPERATEに続き、ACE阻害薬あるいはARB単剤を増量するよりも少量のACE阻害薬とARBを併用する方が蛋白尿の改善に資するという報告もあることから(American Journal of Kidney Diseases Vol 43, No 2 February, 2004: pp 260-268)、併用療法の有効性は強調する必要があります。

ChIP-Seq

Cell, Vol 129, 823-837, 18 May 2007
High-Resolution Profiling of Histone Methylations in the Human Genome

最新号のCellに掲載された上記論文はNIHのNational Heart, Lung, and Blood Instituteによる研究報告で、20種類のヒストンメチレーション(リシンとアルギニン)分布をゲノムワイドにマッピングした驚異的解析です。
彼らはクロマチンIPとSolexa1G Genome Analyzerという次世代シークエンサーを組み合わせてChIP-Seqという新技術を確立し、ゲノムワイドにメチル化状態を評価することを実現した。

ヒストンメチレ−ション抗体で落としてきたDNAを片っ端からシークエンスするという発想(ChIP-Seq)はSolexa1G Genome Analyzerという新技術がなければ現実的には不可能に近い。

用いられた細胞はCD4陽性T細胞で、それを用いた理由は過去に彼らがChIPとSAGEを組み合わせたGMAT(Genome Wide Mapping Technique)という技術開発にT細胞を用いたことやChIP-Seqの結果をCD4陽性T細胞の既知の発現プロファイルと照合する必要があったからだと思われます。
ヒト血液からCD4+T Cell単離キットを用いてCD4陽性T細胞を精製してからMNase処理によって染色体を主にモノヌクレオソームにまで消化することでヒストンの修飾を評価した。細胞はホルムアルデヒドで処理してからソニケーションによって200-300bpの染色体フラグメントにした。2×10^7の細胞から得られた染色体をもとにChIPを行った結果落ちてきたDNAは約200ngで、PNKとクレノー酵素によって末端を修復してからTaqによって3’を突出末端にしてそれをアダプターライゲーションに用いた。さらに一対のSolexaアダプターを修復末端にライゲーションしてからアダプタープライマーで17サイクルのPCRを行い、それらをSolexa1Gシークエンスにかけた。

彼らはChIP-Seqの結果得られたゲノムワイドのヒストン修飾状態を過去に得られているCD4陽性T細胞の12726個の遺伝子発現プロファイルと関連づける解析も行っています。

ChIP-on-chipは革命的技術だと僕は思いますが、ChIP-Seqも技術的革命といえるかもしれない。

IgACE study

J. Am. Soc. Nephrol. Jun 2007; 18: 1880 – 1888.
IgACE: A Placebo-Controlled, Randomized Trial of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors in Children and Young People with IgA Nephropathy and Moderate Proteinuria

European Community Biomedicine Concerted Action Project [BMH4-97-2487(DG 12-SSMI)]の一環としてIgACE European Collaborative Groupによって行われた前向き研究で、Clinical Trials on Medicines for Children (DEC-NET)にも登録されています。

中等度の蛋白尿を伴うIgA腎症の若年患者を対象にACE阻害薬の効果を検証したPlacebo-Controlled無作為二重盲検試験で、今月のJournal of the American Society of Nephrologyに掲載されました。

対象としたのは腎生検にてIgA腎症と診断された3−35歳の若年者で中等度(1-3.5g/day per 1.73m2)の蛋白尿を示しかつ正常か軽度の腎機能低下(Ccr>50ml/min per 1.73m2)を示す患者です。140/90以上の高血圧を伴う成人やステロイド治療を受けた患者は除外されています。クライテリアを満たし実際の試験対象となったのは9-35歳の患者66人で、用いられたACE阻害薬はベナゼプリルです。

平均35ヶ月のフォローアップデータではACE阻害薬群は偽薬群に比してCcrと蛋白尿いずれも有意な有効性が確認された。蛋白尿はACE阻害薬開始後1年以内に著明に減少することも確認された。
Primary end pointとされたのはCcr:30%以上の腎機能増悪を示した場合で、偽薬群では5/34人であったのに対してACE阻害薬群では1/32人だった。
Secondary end pointとされたのは二つあり、一つはCcr:30%以上の腎機能増悪を示すかあるいは3.5g/day per 1.73m2以上までの蛋白尿を示した場合であり、この場合ACE阻害薬群では1/32人に対して偽薬群では9/34人と明らかな差が認められた。またCox解析によりACE阻害薬は独立した予後規定因子であることが確認された他、性別、年齢、血圧等の因子は腎障害の進行と相関が認められなかった。
もう一つのSecondary end pointは6ヶ月以上にわたり0.5g/day per 1.73m2未満の部分的蛋白尿寛解を示すか160mg/day per 1.73m2未満の蛋白尿完全寛解を示した場合であり、この場合部分的蛋白尿寛解はACE阻害薬群では13/32人に対して偽薬群では3/34人、完全蛋白尿寛解はACE阻害薬群では12/32人に対して偽薬群では0/34人となり、いずれにおいてもACE阻害薬の有効性が確認された。

Scr≦1.5 mg/dlかつ蛋白尿≧0.5 g/dのIgA腎症の成人患者を対象にした前向き無作為比較試験は過去にも行われており、血清Cre値と尿蛋白量をエンドポイントとしてACE阻害薬の有効性は確認されている[J Am Soc Nephrol 14: 1578-1583, 2003]。

ステロイド治療と同様にIgA腎症に対するACE阻害薬の有効性は確立されつつある。

NKF-KDOQI Guidelines

American Journal of Kidney Diseases, February 2002
Clinical Practice Guidelines for Chronic Kidney Disease: 　Eval　uation, Classification and Stratification

腎不全患者の腎機能評価にあたりGFRの推定は必須です。
NKFガイドラインでは成人の場合MDRD式とCockcroft-Gault式によるGFRの推定を奨励しています。
MDRD式GFR計算式は少し複雑ですが、関数電卓を使えば問題ありません。
NKFのホームページでは必要な値を入力すれば自動的にMDRD式GFRを計算してくれるGFR Calculatorを公開していますが、日本人に対するModificationは考慮されていません。日本腎臓学会ではMDRD式に日本人係数0.881を掛けると相関が良いことを報告しています。血清クレアチニン値は酵素法の場合、その値に0.2mg/dlをたすことも注意が必要です。
MDRD式GFRは2002年のガイドラインで発表されたにもかかわらず依然として本邦では認識が浅い。

National Kidney Foundation(NKF)は大変充実した最新のclinical practice guidelinesをホームページで公開しています。
腎不全の治療にあたる全ての臨床医はこのガイドラインを十分に活用する必要があります。
内容は素晴らしい。
http://www.kidney.org/professionals/KDOQI/guidelines.cfm

Ras intensity

Nature Cell Biology. 2007 May, Volume 9 No 5
Dose-dependent oncogene-induced senescence in vivo and its evasion during mammary tumorigenesis

テトラサイクリン濃度依存的にH-RasV12の発現量を変化させることを可能にしたトランスジェニックマウスを用いて、マウス乳腺における組織学的変化とoncogene induced senescenceを評価した論文です。
少し難解な論文ですが、Oncogenic Rasの発現量の違いによる効果をvivoで評価した価値ある論文です。

Oncogenic Rasの発現量の大小によって乳腺発育の表現型に明らかな差が認められ、その表現型をoncogene induced senescenceで説明しています。次に低レベルのOncogenic Ras発現によって最終的に形成される乳腺腫瘍のRas発現を組織学的に評価することでspontaneousなRas発現上昇が腫瘍形成過程に重要であり、spontaneousなRas発現上昇によるsenescenceが破綻することで腫瘍化が進行するというステップをvivoで示唆しています。

テトラサイクリン中止後にsenescenceを起こしたはずの細胞が増殖を再開する結果に対する考察は興味深い。Rasにより可逆的細胞周期停止と不可逆的細胞周期停止の両方が起こり、senescenct cellは増殖を再開しないが、Non senescent cellはRasのdown regulationによって増殖を再開するというsuggestionをもってこの論文は結ばれています。
Senescenceは基本的に不可逆的な細胞周期停止なので、最終的にそれに矛盾しない示唆を与えてはいますが、Oncogenic Ras発現上昇によって生じたNon-senescent cell cycle arrest cellについての記述はDiscussionに委ねられています。Stem cellやProgenitor cellはOncogenic Rasによるanti-proliferative/pro-senescenceな状況下でも生き残り、再び増殖する可能性を秘めているというモデルを支持するとDiscussionには書かれています。

A jewel in sandhill

Nature. 1970 Jun 27;226(5252):1211-3.
RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus.
Temin HM, Mizutani S.

僕の研究室のボスはよく逆転写酵素を発見したHoward. M. Teminの話を挙げます。
セントラルドクマを覆した科学史の大きなパラダイムチェンジである逆転写酵素の発見にはサイエンスの常識に対峙する一人のサイエンティストの固い信念があったに違いありません。

科学史を顧みると、砂丘に埋もれた宝石を探すような途方もない努力の中で奇跡的に宝石を見つけることができたほんの一握りの科学者が歴史に名を刻む一方で、数多の科学者が砂丘に身を投じて二度と陽を見ることなく埋もれていったことを僕らは想像することができます。

信念と忍耐は科学者に必要な条件かもしれませんが、方向や手段を誤れば永遠に光を見ることはできません。
サイエンスは海図のない大航海時代に似ているかもしれません。
地図があるから進むのではありません。研究は未知への航海です。その先に大陸があると誰が断言できるでしょうか。
重要な舵取りの判断で研究者の運命は決まるとボスは言います。けれどその判断は難しい。

最初の癌抑制遺伝子であるRbの単離やインスリンの発見は砂丘に埋もれた宝石の発見と例えることができるかもしれません。科学史上の大発見には運があったと後世の人々は言うことができるかもしれません。
けれど科学的根拠に基づいて研究者自身が描いた海図をどんな不安な状況でも離さなかった信念があったことは大発見にも共通する事実かもしれません。

Universal red blood cells

Nature Biotechnology. 2007 Apr;25(4):454-64
Bacterial glycosidases for the production of universal red blood cells

A型やB型の血液をO型に変える酵素についての論文です。
今月のNature Biotechnologyに掲載された上記論文は新聞でも触れられたため知っている方も多いかと思います。
一般的に知られている血液型は赤血球の血液型です。
赤血球表面にある糖蛋白と糖脂質のオリゴサッカライド鎖の末端に存在するABHと呼ばれる糖鎖構造によってABO血液型は分類されます。A型はGalNAc、B型はGalというモノサッカライドがあります。
glycosyltransferaseという酵素遺伝子が血液型を決定していて、少数のアミノ酸置換が異なる基質特異性を決定しています。A型の場合はUDP-GalNAc、B型の場合はUDP-Gal、O型の場合は不活化型の蛋白をコードしています。

O型はA抗原もB抗原も持たないため、どんな血液型の人にも安全に輸血することができます。
レシピエントの血液型を問わないユニバーサルな血液型であるO型は血液バンクにとって貴重な血液型です。
A型やB型の血液をO型に変換する酵素については以前から報告がありますが、多量の酵素が必要とされることや酵素の変換効率が律速段階となっていました。

上記論文では2500種類の細菌や真菌を対象に適正な基質特異性と至適pHが中性で働く酵素をスクリーニングした結果、2つの未知のグルコシダーゼファミリーを同定したと報告しています。
その酵素は高い基質特異性を持ち、至適pHが中性であり、高い効率と選択性をもってA型/B型/AB型の血液をO型に変換できるとしています。

輸血に関してドナーの血液型が問われない時代が来るのもそう遠い未来ではないかもしれません。

Thyroid hormone

今の時期は都会でも公園の池などには多くのオタマジャクシを見つけることができます。
先週末に行った本郷給水所公園でもたくさんのオタマジャクシを見ることができました。

チロシンのリン酸化が生物学的に大変重要であることはよく知られていますが、甲状腺ホルモンはその生物学的活性を発揮するためにチロシンのヨウ素化を必要とすることが大きな特徴です。
諸外国では土壌中にヨウ素が少なく、そのため食物中に含まれるヨウ素が少ないためにヨウ素欠乏症が起こりやすいことが知られています。
660kDという巨大なタンパク質であるthyroglobulinのヨウ素化を経て、甲状腺ホルモンであるT3(triiodothyronine)とT4(thyroxine)は産生されます。甲状腺機能低下症に対してはホルモン補充療法として合成T4(levothyroxine)を経口投与します。

甲状腺ホルモンの重要性はそれがないとオタマジャクシがカエルに変態できないことでよく知られていますが、ヒトの正常な発育にも甲状腺ホルモンは必要です。先天性甲状腺機能低下症では治療が遅れると永続的な脳障害を来たし、重症かつ不可逆的な知能発達障害を残すため、日本では新生児マススクリーニングで全ての新生児を対象に甲状腺機能の検査が行われています。

夏が近づきカエルの大合唱が聞こえてくる頃、甲状腺ホルモンの生理的重要性とヨウ素という稀少元素を利用するために生命が備えたメカニズムを思い出すことができます。