Human iPS cells

Cell 131, 1-12, November 30, 2007
Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors

最新号のCellのImmediate Early Publicationに掲載された上記論文は京大の山中先生の研究グループによるヒトiPS細胞樹立の報告です。以前僕はiPS細胞という記事を書いたことがありましたが、今回彼らはヒトの皮膚線維芽細胞からiPS細胞を樹立することに成功しました。

ヒト線維芽細胞(HDF)はMEFに比べてレトロウイルスの感染効率が低いことは経験的事実です。彼らはGFP導入効率20％以下というHDFの低い感染効率を向上させるため、マウス受容体であるSlc7a1をレンチウイルスによってHDFに導入することでヒト細胞にエコトロピック受容体を発現させた。ウイルス受容体の宿主域を変えることで感染効率を向上させた点ではVSV-Gと同じですが、彼らはこの方法によりHDFの感染効率をMEF並みに上昇させることに成功したと述べています。

36歳の白人女性の顔面皮膚から得られた皮膚線維芽細胞にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの４種類の遺伝子をPlatEで産生させたレトロウイルスにより導入し、6日間10%FBS添加DMEMで培養した後にフィーダー細胞上に捲き、その後bFBS添加ES培地で24日間培養することでヒトiPS細胞樹立に成功した。

Wnt signal and senescence

Molecular Cell 27, 183–196, July 20, 2007
Downregulation of Wnt Signaling Is a Trigger for Formation of Facultative Heterochromatin and Onset of Cell Senescence in Primary Human Cells

Wntシグナル伝達とsenescenceの関係はおそらく単純ではない。
今年７月のMolecular Cellに掲載された上記論文はヒト正常線維芽細胞において内在性のWnt2がGSK3βによるHIRAのリン酸化を介してsenescenceを負に制御することをVitroで示していますが、この論文と前回紹介したScienceの論文には矛盾する点が少なくない。

Wntの種類によってsenescenceに対する影響は異なる。
Molecular Cellの論文からヒト正常線維芽細胞において内在性のWnt2がsenescenceを抑えていることは確からしい。またWnt5a/bはsenescenceか否かに関わらず転写レベルの発現の変化はないようです。
Wnt1はScienceの論文でK5rtTA/tet-Wnt1マウスを使った実験結果があり、ドキシサイクリン処理によって皮膚のγH2AX染色陽性が確認されています。

Wnt3については両者で結果が異なる。
Molecular Cellでは replicative senescenceがWnt3a conditioned mediumとrecombinant Wnt3aによって抑えられることをSAHFの形成、HIRAのPMLへの移動、BrdU、細胞数で示しています。またRas induced senescenceがWnt3a conditioned mediumとrecombinant Wnt3aによって抑えられることもBrdUで示しています。細胞はWI38を使っています。
Scienceでは主にMEFを使っていますが、Wnt3a conditioned mediumとrecombinant Wnt3aによってsenescenceが惹起されることをBrdU、SA-βGal染色、免疫染色(HP1α/γH2AX/53BP1/p-ATM)、増殖曲線によって示しています。またWI38でもWnt3aによってsenescenceが惹起されることを増殖曲線と免疫染色(HP1α/γH2AX/53BP1/p-ATM)で示しています。

同じ細胞(WI38)を使った実験でも両者で結果が異なる。
実験上の違いとしてはWnt3aの濃度がScienceでは10-30ng/ml、Molecular Cellでは50-75ng/mlであることと、細胞年齢がScienceではP12-22、Molecular CellではPD43-65であることくらいです。

Molecular CellではSupplemental Figureの最後にβ-cateninによってWI38の増殖抑制が認められることをBrdUで示した図を載せていますが、この説明としてはDiscussionの中でWntシグナルとsenescenceには複合的経路が存在するようだという記述をしているのみです。

研究者は常に真実を追求していますが、何年か実験を続けていると真実というのは畢竟するところ歴史にしか証明され得ないように思う時があります。
実験結果を変えうる様々な要因をどれだけ把握できるか、再現性を得るにも失うにもこの知識が実験科学者の力量ではないかと思うことがあります。

Wnt signal and aging

Science 317, 803 (2007)
Augmented Wnt Signaling in a Mammalian Model of Accelerated Aging

Klothoという遺伝子のノックアウトマウスは早期に老化現象が現れるマウスとして知られています。この特徴的な表現型に潜むメカニズムに迫る論文が今月初めのScienceに掲載されました。

Klothoノックアウトマウスでは皮膚や小腸等の組織でstem cellやprogenitor cellの数が減少し、代わりにsenescence cellが出現していることを確認し、293細胞でKlothoとWnt3の発現分布が重複していることを発端にKlothoがWntシグナルと相互作用することを証明し、TOPGALマウスとの交配によりKlothoノックアウトマウスの組織でWntシグナルが亢進していることを示し、最後にWntシグナルがcellular senescenceを惹起することをvitroとvivoで示しています。

簡単に言うと、KlothoはWntシグナルを抑えていて、KlothoがなくなるとWntシグナルが亢進してcellular senescenceになり、それが個体の老化促進に寄与しているようだという内容です。KlothoとWntシグナルとsenescenceをvitroとvivoで見事に結びつけたこの研究はScienceに掲載されるだけの大きな業績だと思います。

Wnt signalとsenescenceに関する論文は僕が渉猟する限り2001年のEMBO以外に報告がありませんでしたが、先月のMolecular Cellに続いて今回の論文が発表されました。Wnt induced senescenceという新しい概念は僕が現在進めている研究でもあり、今回発表された論文のFigureの幾つかは僕の出している結果と重複しています。
今回の論文の紹介を通じてボスを交えてDiscussionをしなければいけません。

ENCODE

Nature. Vol 447. 14 June 2007
Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project

ヒトゲノムという広大なフロンティアにはまだ我々人類が知らない未知の世界が広がっています。
ヒトゲノムの全塩基配列を解読するヒトゲノムプロジェクトがホットトピックとなってから早数年。あの頃NHKスペシャルでアメリカのセレラ社のシークエンサーが列をなしてフル稼働している映像を見て生命科学の新時代の幕開けを感じたものです。

その後の目覚ましい科学技術の進展によって加速したヒトゲノムプロジェクトによって、果たして人類はATGCの遺伝暗号が敷き詰められた広大なゲノムのフロンティアを見渡すことができるようになりました。

2004年10月のScienceにENCODEプロジェクトが発表されてから3年を待たずして、パイロットプロジェクトとして計画されたゲノムの1%にあたる30Mbの機能解析が完了し、先月Natureに報告されました。

ENCODE（The Encyclopedia of DNA Elements）はDNAの百科事典と略されますが、 遺伝暗号に秘められた機能を解き明かすゲノムワイドの実験はその名に相応しい人類の挑戦と言えるかもしれません。
そこから明らかになった知られざる転写と翻訳のメカニズムを今回のパイロットプロジェクトは提供しています。

現在のサイエンスの筆頭に挙げられるほど目覚ましい進展を続ける生命科学は個々の遺伝子の分子生物学的研究の膨大な蓄積によって相当の機能解析がなされていることは事実です。
けれどENCODEでしかできない研究、つまり国際的視野に立って各国の専門家と資材を科学的インフラとして統合し、各国の秀逸な人材と巨額の資金を投じる世界規模の共同研究にはそれにしかできない大きな成果が期待できます。

パイロットプロジェクトの対象とされた30Mbは44のゲノム領域に位置していて、15Mbは既に生物学的解明が成されている14領域で、残りの15Mbは無作為抽出法によって選択された30領域に位置しています。

ENCODEでは分子の挙動である生化学的機能とその結果の個体の生物学的役割を明確に区別しています。
前回の記事の内容と重複する知見もありますが、ゲノムはかなり広汎に転写されること、多くのNon protein coding transcriptsが同定されたこと、これまで知られていなかった多くの転写開始点が同定されたこと、転写開始点周囲の制御配列は決して上流優位なのではなく対称に分布すること、染色体とヒストンの修飾が転写開始点の存在と活性を強く予測すること、実験によって機能していることが明らかになった領域と進化的に保存されている領域は必ずしも重複しないこと、多くの機能的要素が哺乳類間で保存されていないこと、つまり生化学的活性はあるものの個体として特異的利点がない、機能的に保存されているが種間で非相同遺伝子的要素であることなどが明らかになりました。

ENCODEは機能解析ですからシークエンスをひたすら行うヒトゲノムプロジェクトとは全く異なり、ゲノムワイドの多くの実験の統合です。35グループがタイリングアレイ、RT-PCR、ChIP-ChIP、RACE、EST、CAGE、PETなどのデータを統合してウェットとドライの結果を出しています。

内容は非常に濃いのでここでは詳しくは説明しません。この論文一つを完全に理解すれば現在のゲノム科学を知ることができると言っても過言ではないような気がします。必要とされる知識も多く、僕も完全には理解していません。

このプロジェクトが終了する未来にライフサイエンスはどうなっているんだろう。
僕は理由なく未来のサイエンスへの興奮を覚える。
“The great ocean of truth lay all undiscovered before me.”
ニュートンが感じた海はいつの時代もサイエンティストの心の中に広がっている。

The plasticity of transcription

Nature Genetics. 39, 730-732 (2007)
Tissue-specific transcriptional regulation has diverged significantly between human and mouse

今月のNature Geneticsに掲載された上記論文は大変面白い。
生命の進化の過程で保存された転写調節メカニズムは異種間の転写因子の標的配列の相同性に準じると多くの人は想像するかもしれません。
同じ転写因子であればマウスとヒトで結合遺伝子は同じだろうか。結合部位は同じだろうか。異種間で保存されたアライメントに準じて結合するだろうか。
答えはNoである。
それをこの論文は検証した。
進化的に保存された同じ転写因子であっても結合が異種間でかなり異なることを示したこの論文は同じほ乳類としてヒトの代用を果たしているマウスの研究結果に再考を迫るだろう。

方法はChIP-on-chipです。
まずカスタムメイドのマイクロアレイですが、彼らは4000種類以上のヒトとマウスのオーソログ(異種間相同遺伝子)に対して転写開始点前後5kbの範囲で60merのオリゴヌクレオチドをプローブとして設計した。
抗体は４つの転写因子(FOXA2,HNF1A,HNF4A,HNF6)を用い、細胞はヒトとマウスの肝臓からそれぞれ単離した初代肝細胞を用いた。

結果はこれらの転写因子が結合するオーソログの実に41-89%がヒトとマウスで異なるという驚くべき結果だった。つまり同じ転写因子であってもその結合遺伝子の41-89%は種特異的である。
またHNF6についてヒト初代肝細胞と不死化ヒト肝細胞株であるHepG2を比較したところ、結合オーソログの66%を共有したのに対して、マウス初代肝細胞とは26%しか結合オーソログを共有しなかった。つまり異種間の違いは初代培養細胞と不死化細胞株という同種間の違いよりも大きい。

異種間の結合パターンの違いは転写因子のDNA結合特異性の違いに起因するのではなく、蛋白モチーフに合致した配列の有無と強く相関することをTHEMEアルゴリズムで示した後に、結合する場合も結合部位は種間でかなり異なることを示しています。すなわち 同じ転写因子の結合部位をヒト-マウス間で比較した結果、約2/3でアライメントの一致が認められず、結合部位はヒト-マウス配列アライメントからだけでは予測できないことを示しています。
ヒトとマウスにおけるこの違いは転写因子結合部位の高い可動性を意味します。この転写因子結合の高い可塑性は異種間で保存された領域が機能的に重要だという前提の方法論であるファイロジェネティックフットプリンティングにも再考を迫る論文ではないかと思います。

ChIP-Seq

Cell, Vol 129, 823-837, 18 May 2007
High-Resolution Profiling of Histone Methylations in the Human Genome

最新号のCellに掲載された上記論文はNIHのNational Heart, Lung, and Blood Instituteによる研究報告で、20種類のヒストンメチレーション(リシンとアルギニン)分布をゲノムワイドにマッピングした驚異的解析です。
彼らはクロマチンIPとSolexa1G Genome Analyzerという次世代シークエンサーを組み合わせてChIP-Seqという新技術を確立し、ゲノムワイドにメチル化状態を評価することを実現した。

ヒストンメチレ−ション抗体で落としてきたDNAを片っ端からシークエンスするという発想(ChIP-Seq)はSolexa1G Genome Analyzerという新技術がなければ現実的には不可能に近い。

用いられた細胞はCD4陽性T細胞で、それを用いた理由は過去に彼らがChIPとSAGEを組み合わせたGMAT(Genome Wide Mapping Technique)という技術開発にT細胞を用いたことやChIP-Seqの結果をCD4陽性T細胞の既知の発現プロファイルと照合する必要があったからだと思われます。
ヒト血液からCD4+T Cell単離キットを用いてCD4陽性T細胞を精製してからMNase処理によって染色体を主にモノヌクレオソームにまで消化することでヒストンの修飾を評価した。細胞はホルムアルデヒドで処理してからソニケーションによって200-300bpの染色体フラグメントにした。2×10^7の細胞から得られた染色体をもとにChIPを行った結果落ちてきたDNAは約200ngで、PNKとクレノー酵素によって末端を修復してからTaqによって3’を突出末端にしてそれをアダプターライゲーションに用いた。さらに一対のSolexaアダプターを修復末端にライゲーションしてからアダプタープライマーで17サイクルのPCRを行い、それらをSolexa1Gシークエンスにかけた。

彼らはChIP-Seqの結果得られたゲノムワイドのヒストン修飾状態を過去に得られているCD4陽性T細胞の12726個の遺伝子発現プロファイルと関連づける解析も行っています。

ChIP-on-chipは革命的技術だと僕は思いますが、ChIP-Seqも技術的革命といえるかもしれない。

Ras intensity

Nature Cell Biology. 2007 May, Volume 9 No 5
Dose-dependent oncogene-induced senescence in vivo and its evasion during mammary tumorigenesis

テトラサイクリン濃度依存的にH-RasV12の発現量を変化させることを可能にしたトランスジェニックマウスを用いて、マウス乳腺における組織学的変化とoncogene induced senescenceを評価した論文です。
少し難解な論文ですが、Oncogenic Rasの発現量の違いによる効果をvivoで評価した価値ある論文です。

Oncogenic Rasの発現量の大小によって乳腺発育の表現型に明らかな差が認められ、その表現型をoncogene induced senescenceで説明しています。次に低レベルのOncogenic Ras発現によって最終的に形成される乳腺腫瘍のRas発現を組織学的に評価することでspontaneousなRas発現上昇が腫瘍形成過程に重要であり、spontaneousなRas発現上昇によるsenescenceが破綻することで腫瘍化が進行するというステップをvivoで示唆しています。

テトラサイクリン中止後にsenescenceを起こしたはずの細胞が増殖を再開する結果に対する考察は興味深い。Rasにより可逆的細胞周期停止と不可逆的細胞周期停止の両方が起こり、senescenct cellは増殖を再開しないが、Non senescent cellはRasのdown regulationによって増殖を再開するというsuggestionをもってこの論文は結ばれています。
Senescenceは基本的に不可逆的な細胞周期停止なので、最終的にそれに矛盾しない示唆を与えてはいますが、Oncogenic Ras発現上昇によって生じたNon-senescent cell cycle arrest cellについての記述はDiscussionに委ねられています。Stem cellやProgenitor cellはOncogenic Rasによるanti-proliferative/pro-senescenceな状況下でも生き残り、再び増殖する可能性を秘めているというモデルを支持するとDiscussionには書かれています。

Universal red blood cells

Nature Biotechnology. 2007 Apr;25(4):454-64
Bacterial glycosidases for the production of universal red blood cells

A型やB型の血液をO型に変える酵素についての論文です。
今月のNature Biotechnologyに掲載された上記論文は新聞でも触れられたため知っている方も多いかと思います。
一般的に知られている血液型は赤血球の血液型です。
赤血球表面にある糖蛋白と糖脂質のオリゴサッカライド鎖の末端に存在するABHと呼ばれる糖鎖構造によってABO血液型は分類されます。A型はGalNAc、B型はGalというモノサッカライドがあります。
glycosyltransferaseという酵素遺伝子が血液型を決定していて、少数のアミノ酸置換が異なる基質特異性を決定しています。A型の場合はUDP-GalNAc、B型の場合はUDP-Gal、O型の場合は不活化型の蛋白をコードしています。

O型はA抗原もB抗原も持たないため、どんな血液型の人にも安全に輸血することができます。
レシピエントの血液型を問わないユニバーサルな血液型であるO型は血液バンクにとって貴重な血液型です。
A型やB型の血液をO型に変換する酵素については以前から報告がありますが、多量の酵素が必要とされることや酵素の変換効率が律速段階となっていました。

上記論文では2500種類の細菌や真菌を対象に適正な基質特異性と至適pHが中性で働く酵素をスクリーニングした結果、2つの未知のグルコシダーゼファミリーを同定したと報告しています。
その酵素は高い基質特異性を持ち、至適pHが中性であり、高い効率と選択性をもってA型/B型/AB型の血液をO型に変換できるとしています。

輸血に関してドナーの血液型が問われない時代が来るのもそう遠い未来ではないかもしれません。

Driver or Passenger

Nature. 2007 Mar 8;446(7132):153-8
Patterns of somatic mutation in human cancer genomes

「生命はなぜリン酸化を選択したか」
昔どこかの文章で目についたこの文が今でも僕の記憶に強く残っている。
生物界のエネルギー代謝の中心がATP-ADP系であることを考えると、地球の太古の生命はリン酸化と脱リン酸化をエネルギー代謝に選んだといえるかもしれない。

生命科学分野でリン酸化酵素(kinase)は細胞周期やシグナル伝達に重要な役割を果たしていて、その変異と癌化の関係はよく知られています。

今月初めのNatureに掲載された上記論文は518種類のリン酸化酵素遺伝子のcoding exonとsplice junction領域を対象に大規模なシークエンスを行い、癌のsomatic mutationをスクリーニングしました。
対象とした癌サンプルは様々な種類の癌検体169個、初代培養2個、不死化癌細胞株39個の計210サンプルで、シークエンスした領域は計274MBに渡ります。

このような大規模シークエンスによる癌変異検索はこれに先だち昨年10月のScienceに発表されていて、その論文では乳癌と大腸癌それぞれ11サンプルを対象にして13023個の遺伝子を対象に大規模シークエンスを行っています[Science 13 October 2006 314: 268-274]。

大規模なプロジェクトは単なる癌遺伝子のスクリーニングが目的ではありません。
癌の種類によってもまた同じ種類の癌であっても変異の数が大きく異なることは予想された結果かもしれませんが、それを科学的に評価したことにこの論文の一つの価値があると思います。
一言に変異と言っても様々な変異があり、その中で実際に癌化に寄与する変異がどれほどあるかを評価することは研究者にとって関心があります。
アミノ酸が変わらない(synonymous)変異と変わる(non-synonymous)変異では機能的および構造的変化を及ぼすnon-synonymous変異に生物学的選択が発揮されるという前提のもと、non-synonymous/synonymousの比が偶然に期待されるそれに比較して高い場合をdriver mutationとして、そうではない場合をpassanger mutationとした。

リン酸化酵素518種類のcoding exonをシークエンスした結果確認された921ベースの置換変異のうち、763はpassanger mutationであり、158がdriver mutationであったことから、癌ゲノムのシークエンスを通して見つかった変異の大部分が実際には発癌に関係しないpassanger mutationであることがわかり、またdriver mutationは119遺伝子に相当すると報告しています。

Cold Spring Harbor Laboratory

Nature 445, 656-660 (8 February 2007)
Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas

Cold Spring Harbor LaboratoryのScott W. Loweは僕が尊敬する研究者の一人です。
先月のNatureに掲載された上記論文もさすがだと思う。

彼らはマウス胎生liver progenitor cells(hepatoblast)をpurifyし、H-ras V12とテトラサイクリンtransactivator 蛋白[tTA(tet-off)]とtet反応性p53shRNAをレトロウイルスにより導入した。その細胞を経脾臓注射によって胸腺欠損ヌードマウスの肝臓に移植することでテトラサイクリン依存的にエンドのp53発現を回復させることができるコンディショナルマウスを作製した。H-ras V12によりマウスの肝臓には腫瘍が形成されるが、テトラサイクリン投与により一時的にエンドのp53発現を回復させることでその効果をvivoで評価することを実現した。またH-rasベクタ−にGFPを組み込み、幾つかの実験ではルシフェラーゼレポーターベクターをco-transductionすることでin vivoイメージングを可能にしている。理論的には可能でもそれを実際に実験系として確立することがどれだけ困難かを実験科学者は知っている。斬新な理論を再現性のとれる確立した実験系として実現させる技術はさすがだと思わざるを得ない。

困難が予想されようとも確立する価値のある実験系をトップサイエンティストは知っている。
優れたボスはそれが実現可能な最良の方法であると判断する客観的な判断力に加えて、それを効率的に実現させるためのオーガナイザーあるいは経営者としての資質を備えている。
優れたスタッフの努力と優れたボスのナビゲーションによって確立された実験系はトップジャーナルの掲載を約束すると言って過言ではない。

サイエンスの先見性だけでなく、優れたボスはスタッフと資金の使い方に長けている。
どんなにスタッフが優れていてもまたボスが優れていても、 片方だけでは大きな仕事はできない。
それらの能力を最大限に発揮するためには両者の協力が必要です。

p53発現回復により肝臓腫瘍は劇的な退縮が認められたが、この効果はアポトーシスではなくsenescenceによるものであることを組織染色とvitroの実験で示した。
もはやsenescenceがアポトーシス同様あるいはそれ以上に重要なp53によるtumor suppressor mechanismであることは明らかだといってよいでしょう。同じ号のNatureの別の論文でもp53による腫瘍抑制にsenescenceが働いていることをマウスの組織染色で示している(Nature 445, 661-665)。

この論文の新規性は以上にとどまらない。彼らはp53による腫瘍の退縮に免疫反応が寄与しているデータを示し、そこにsenescenceが関与していることを示唆する知見を与えている。

senescenceが不可逆的な細胞周期停止だけでなく免疫反応の惹起を通して腫瘍を抑制するという機序を有するとすれば、senescence研究のフロンティアは広い。